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　　目前皮膚致敏性試驗方法有：豚鼠最大劑量法(GPMT)、封閉式貼敷法(Buehler試驗)、局部淋巴結(jié)試驗法(LLNA)，其中豚鼠最大劑量法(GPMT)和封閉式貼敷法(Buehler試驗）是最常用的、生物安全性評價中使用率最高的兩種方法。

 

　　豚鼠最大劑量試驗是最敏感的方法，歐洲國家使用此方法較廣泛；封閉式貼敷試驗適用于局部產(chǎn)品，美國常用此方法。局部淋巴結(jié)試驗(LLNA）被經(jīng)濟與合作發(fā)展組織接受作為當前豚鼠試驗的唯一替代方法，該法對動物保護方面也有所改善，也被認可用于化學(xué)物致敏活性的檢測。

 

 

　　原理：過敏劑可誘導(dǎo)引起作用位點的引流淋巴結(jié)內(nèi)淋巴細胞增殖，其增殖程度與過敏劑的劑量和致敏效力成正比。從而提供了一種簡單的獲取定量測量致敏性的方法。BrdU是胸腺咤啶核苷的類似物并可摻入增殖細胞的DNA中。

 

　　通過酶聯(lián)免疫吸附試驗方法測量試驗動物耳部引流淋巴結(jié)內(nèi)摻入BrdU的量來指示增殖細胞的數(shù)量增加，并用試驗組與對照組的平均增殖量之比(SI)來評價增殖情況，確定待測物質(zhì)的致敏潛能。

 

　　動物管理：成年未生育過且未受孕的雌性小鼠，8周齡~12周齡，動物體重不超過平均體重的±20%。

 

　　試驗樣品：應(yīng)為液體、懸浮液、凝膠或膏狀物，此類樣品可應(yīng)用小鼠的耳部。

 

　　試驗設(shè)置：設(shè)置一個或多個對照組、一個陰性對照組和一個陽性對照組；每組至少使用4只動物。經(jīng)常進行LLNA時不必每次試驗都包括陽性對照，但至少每6個月應(yīng)采用一次陽性對照。

 

　　試驗步驟：LLNA檢驗化學(xué)物一般采用劑量反應(yīng)方式，醫(yī)療器械供試樣品可能為浸提液，此時僅有單劑量用于試驗，一般可檢驗未稀釋的浸提液。當浸提液含有高毒性成分時，毒性在LLNA中可導(dǎo)致陰性反應(yīng)。因此在LLNA中檢驗高毒性浸提液時，推薦采用劑量反應(yīng)方式和稀釋浸提液。

 

　　在試驗開始和結(jié)束時應(yīng)記錄每只動物體重，將適宜的樣品應(yīng)用于指定小鼠雙耳的背側(cè)，劑量為25uL/d，連續(xù)3天。為了檢驗試驗樣品的潛在毒性，試驗中應(yīng)每天觀察雙耳可能會干擾結(jié)果解釋的刺激跡象并記錄觀察結(jié)果，通過測定每只動物或匯集的淋巴結(jié)樣品來確定淋巴結(jié)反應(yīng)。

 

　　結(jié)果與評價：測定每只小鼠每分鐘淋巴結(jié)細胞計數(shù)(cpm)的放射活性水平。試驗cpm除以空白cpm得出刺激指數(shù)(SI)，試驗樣品SI≥3.0，考慮陽性，為致敏物。陽性對照樣品SI應(yīng)≥3.0。

 

 

　　原理：單一化學(xué)物采用豚鼠最大劑量試驗，對材料在試驗條件下使豚鼠產(chǎn)生皮膚致敏反應(yīng)的潛能做出評定。

 

　　動物與管理：使用健康、初成年的豚鼠，試驗開始時體重應(yīng)為300g~500g，雌雄不限，雌鼠應(yīng)未產(chǎn)并無孕。

 

　　試驗材料若為粉末或液體，至少使用10只動物接觸試驗樣品，至少使用5只動物作為對照組。

 

　　對于浸提液試驗，至少使用10只動物接觸試驗樣品，至少使用5只動物作為溶劑對照組。

 

 

　　皮內(nèi)誘導(dǎo)階段

 

　　1——頭端；

 

　　2——0.1mL皮內(nèi)注射點；

 

　　3——去毛的肩胛骨內(nèi)側(cè)部位；

 

　　4——尾端。

 

　　按上圖在每只動物去毛的肩胛骨內(nèi)側(cè)部位成對皮內(nèi)注射0.1mL。

 

　　A部位：注射FCA與選定的溶劑以50：50體積比混合的穩(wěn)定性乳化劑，對于水溶性材料，溶劑選用生理鹽水。

 

　　B部位：注射試驗樣品即未經(jīng)稀釋的浸提液；對照組動物僅注射相應(yīng)溶劑。

 

　　C部位：試驗樣品以50：50的體積比例與弗氏完全佐劑和溶劑(50%）配置成的乳化劑混合后進行皮內(nèi)注射；對照組注射空白液與佐劑配成的乳化劑。

 

　　局部誘導(dǎo)階段：皮內(nèi)誘導(dǎo)階段后6~8天，按部位B中選定的濃度，采用面積約8cm2的濾紙或吸水性紗布塊局部貼敷于每只動物的肩胛骨內(nèi)側(cè)部位，覆蓋誘導(dǎo)注射點。如按皮內(nèi)誘導(dǎo)階段的最大濃度未產(chǎn)生刺激反應(yīng)，應(yīng)在局部敷貼應(yīng)用前22~26h，試驗區(qū)用10%十二烷基硫酸鈉進行預(yù)處理，按摩導(dǎo)入皮膚。用封閉式包扎帶固定敷貼片，并于46~58h后除去包扎帶和敷貼片。對照組動物使用空白液同法操作。

 

　　激發(fā)階段：局部誘導(dǎo)階段后13~15d后，用試驗樣品激發(fā)全部試驗動物和對照動物。按C部位選定的濃度將適宜的敷貼片置于試驗樣品或介質(zhì)對照中浸透，局部敷貼于誘導(dǎo)階段未試驗部位。該濃度的稀釋液可同法敷貼于其他未試驗部位。用封閉式包扎帶固定，并于22~26h后除去包扎帶和敷貼片。

 

 

　　除去敷貼片后(24士2)h和(48±2)h觀察試驗組和對照組動物激發(fā)部位皮膚情況，在自然光或全光譜光線下觀察皮膚反應(yīng)。按Magnusson和Kligman分級標準，對照動物分級小于1，試驗組中分級大于或等于1時，一般提示致敏。如對照動物分級大于或等于1時，試驗超過組動物反應(yīng)對照組中最嚴重的反應(yīng)則認為致敏。

 

　　如疑似反應(yīng)，進行再激發(fā)以確認首次激發(fā)結(jié)果，試驗結(jié)果顯示為試驗和對照動物中的陽性激發(fā)結(jié)果的發(fā)生率。如試驗組動物出現(xiàn)反應(yīng)的動物數(shù)多于對照組動物，但反應(yīng)強度并不超過對照組，可能需要在首次激發(fā)后1周~2周進行再次激發(fā)，以明確反應(yīng)。所用方法與首次激發(fā)相同，采用動物未試驗的一側(cè)部位。

 

 

　　試驗樣品：按標準規(guī)定的方法進行樣品制備，在不影響結(jié)果解釋的情況下，試驗樣品濃度應(yīng)盡可能的高，試驗樣品的性狀和尺寸適宜，局部應(yīng)用器械可原樣敷貼。

 

　　動物管理：使用健康、初成年的豚鼠，試驗開始時體重應(yīng)為300g~500g，雌雄不限，如雌鼠應(yīng)未產(chǎn)并無孕。

 

　　試驗材料若為粉末或液體，至少使用10只動物接觸試驗樣品，至少使用5只動物作為對照組。對于浸提液試驗，至少使用10只動物接觸試驗樣品，至少使用5只動物作為溶劑對照組。

 

 

　　誘導(dǎo)階段：按選定的試驗樣品濃度，將合適的敷貼片浸透試驗樣品，局部敷貼于每只動物的左上背部位。(6±0.5)h后除去任何封閉式包扎帶類的固定物和敷貼片。1周中連續(xù)3d重復(fù)該步驟，同法操作3周，對照組動物僅使用空白液同法操作。

 

　　激發(fā)階段：最后一次誘導(dǎo)敷貼后(14±1)d用試驗樣品對全部試驗動物和對照動物進行激發(fā)，按選定的試驗樣品濃度將合適的敷貼片浸透試驗樣品單獨局部貼敷于每只動物去毛的未試部位。(6±0.5)h后除去固定物、封閉包扎帶和敷貼片。

 

 

　　首次激發(fā)或再次激發(fā)接觸后(24±2)h，用市售脫毛劑給動物脫毛，將脫毛劑涂到試驗和周圍部位；或剃去激發(fā)部位及周圍部位的動物被毛。

 

　　用溫水徹底清洗脫毛區(qū)，并用毛巾擦干動物后放回籠中。脫毛后至少2h，對試驗部位評分，并在除去激發(fā)貼片后(48±2)h再進行評分。

 

　　按Magnusson和Kligman分級標準，對照動物分級小于1，而試驗組中分級大于或等于1時，一般提示致敏。如對照動物分級大于或等于1時，試驗超過組動物反應(yīng)對照組中最嚴重的反應(yīng)則認為致敏。如為疑似反應(yīng)，進行再激發(fā)以確認首次激發(fā)結(jié)果，試驗結(jié)果顯示為試驗和對照動物中的陽性激發(fā)結(jié)果的發(fā)生率。如試驗組動物出現(xiàn)反應(yīng)的動物數(shù)多于對照組動物，但反應(yīng)強度并不超過對照組，可能需要在首次激發(fā)后1周~2周進行再次激發(fā)，以明確反應(yīng)。所用方法與首次激發(fā)相同，采用動物未試驗的—側(cè)部位。

 

　　以上大致介紹了三種皮膚致敏試驗方法，豚鼠最大劑量法和封閉式貼敷法應(yīng)用廣泛；局部淋巴結(jié)試驗不包括激發(fā)階段，試驗所關(guān)注的終點是刺激指數(shù)(SI)，該試驗周期較短，結(jié)果客觀敏感，所用試驗材料較少，并且免除了弗氏完全佐劑注射。

 

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