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染色體畸變試驗(yàn)的方法

發(fā)布時間：2021-09-10 469

　　染色體畸變是基因突變的一種形式，通常后果比較嚴(yán)重。可用外周血淋巴細(xì)胞，或人和哺乳動物體細(xì)胞系作為材料進(jìn)行檢測，常用的體細(xì)胞系有中國地鼠卵巢細(xì)胞(CHO)，中國地鼠肺成纖維細(xì)胞(V79和CHL)，人胚肺2倍體成纖維細(xì)胞等。

　　一、染色體畸變試驗(yàn)原理

　　外周血中小淋巴細(xì)胞幾乎都處在細(xì)胞增殖周期的G。期或G。期(不同于體外培養(yǎng)的體細(xì)胞)。一般條件下是不會再分裂的。當(dāng)在培養(yǎng)物中加入適量的植物血凝素(phytohernagglu—tinin，PHA)，37℃培養(yǎng)52～72h后，淋巴細(xì)胞開始轉(zhuǎn)化，進(jìn)入細(xì)胞增殖周期，此時可獲得大量的有絲分裂細(xì)胞。再經(jīng)過秋水仙素處理，低滲、固定，即可在顯微鏡下觀察到良好的中期染色體分裂象。電離輻射，化學(xué)有害物質(zhì)作用于機(jī)體或體外細(xì)胞，均可引起細(xì)胞染色體的損傷，且損傷與劑量(濃度)呈良好的線性關(guān)系。

　　二、材料與方法

　　(一)染色體畸變試驗(yàn)材料

　　1．受試材料：外周血淋巴細(xì)胞。

　　2．RPMI 1640培養(yǎng)液，含20％小牛血清。

　　3．肝素：用生理鹽水配成500U／ml，4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/div>

　　4．秋水仙素：用0．85％生理鹽水配成40μg／ml濃度，過濾后4℃冰箱保存。

　　5．促細(xì)胞分裂劑：植物血凝素(PHA)。

　　6．KCl低滲液：配制75mmol／L KCl水溶液。

　　7．固定液(甲醇：冰醋酸=3：1)。

　　(二)染色體畸變試驗(yàn)方法

　　1．受試物的處理實(shí)驗(yàn)分組，至少設(shè)立五個組，即陽性對照、陰性(溶劑)對照及三個劑量組。zui高劑量和zui低劑量之間相差10倍，中間再設(shè)一個劑量，陽性對照物為已知的染色體斷裂劑，如C(mitomycin c，MMC)，劑量為o．02μg／ml；黃曲霉素毒素Bl，濃度為10-6 M等。每組中應(yīng)設(shè)2～3個平行樣品。

　　2．外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)培養(yǎng)。

　　3．收集細(xì)胞經(jīng)受試驗(yàn)處理的細(xì)胞，培養(yǎng)開始后52～72h收集細(xì)胞。依不同受試物收集時問有所差異。

　　4．加入秋水仙素培養(yǎng)終止前4h于培養(yǎng)物中加入40μg／ml秋水仙素，終濃度為0．4～0.8μg／ml，37℃培養(yǎng)。

　　5．制片。

　　6．染色用(}iem∞染液染色15min，用自來水輕輕沖洗殘留染液，待干。

　　7．鏡檢先在低倍鏡下尋找分散良好的分裂象細(xì)胞，然后用高倍鏡觀察，進(jìn)行染色體畸變計(jì)數(shù)，分析，分別記錄染色體畸變細(xì)胞數(shù)及各種類型染色體畸變細(xì)胞數(shù)，選擇良好的典型的染色體畸變圖進(jìn)行顯微照相。